เคมีคลินิก ที่ MT ควรรู้

เป็น ความรู้ที่บางคนจำไม่ได้แล้ว ไม่ใช่ว่าไม่รู้นะครับเพราะทุกคนผ่านมาตั้งแต่ตอนเรียนแล้ว แต่ตอนเรียนไม่ค่อยสนใจเท่าไหร่ (เหมือนผมเป็นต้น)

เห็นบทความดีๆ เลยเอามาลงไว้ น่าสนใจ และมีความรู้ขึ้นเยอะครับ
คัดลอกมาจากที่นี่ครับ ขอขอบคุณมา ณ.ที่นี้ด้วยครับ http://www.rsu.ac.th/medtech/%E0%B8%96%E0%B8%B2%E0%B8%A1%E0%B8%95%E0%B8%AD%E0%B8%9A%E0%B9%80%E0%B8%84%E0%B8%A1%E0%B8%B5%E0%B8%84%E0%B8%A5%E0%B8%B4%E0%B8%99%E0%B8%B4%E0%B8%81/word/clinchem_review.doc

Clinical Chemistry Review

Glassware ที่สำคัญได้แก่

1.1 Borosilicate glass ได้แก่ Pyrex^â , Corex^â, Kimax^â, Vycor ^â นิยมใช้มากในห้องปฏิบัติการ

1.2 Soda-lime glass หรือ flint glass ไม่ใช้ในกรณีที่มีการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างมาก นิยมใช้ทำ volumetric flask, stirring rod และ disposable pipette

1.3 Low actinic glass (amber-colored glass) ใช้ทำขวดใส่สารที่เป็น light-sensitive reagents

1.4 Boron-free glass ทนด่างได้ดี ไม่ทนความร้อน

1.5 High silica glass ใช้ทำ spectrophotometric cuvette

1. การกำหนดปริมาตรของ glassware:

2.1 TC (to contain) ได้แก่ volumetric flask, Sahli pipette

2.2 TD (to deliver) แบ่งเป็น 2 ชนิดคือ

- blow out ได้แก่ Ostwald-Folin pipette

- non- blow out ได้แก่ volumetric pipette, serological pipette, Mohr pipette

1. การล้าง glassware:

3.1 Cleaning solution (conc. H₂SO₄+ Sodium or Potassium dichromate)

3.2 Detergent เช่น Alconox^â

3.3 1 N HCl หรือ 1 N HNO₃ ใช้ในกรณีการวิเคราะห์หา trace elements

1. Plastic ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการได้แก่

4.1 Polyolefins ได้แก่ polyethylene(PE), polypropylene(PP), polymethylpentene(PMP) ทนกรด ทนด่างได้ดี บางชนิดเช่น PP, PMP สามารถ autoclave ได้

4.2 Polycarbonate เป็น plastic ใส นิยมใช้ทำ centrifuge tube, dessicator, anaerobic jar ทนความร้อนได้ดีแต่ไม่เหมาะในกรณีที่สารละลายเป็นกรดหรือด่างแก่ สามารถ autoclave ได้ไม่เกิน 20 นาที

4.3 Fluorocarbon (Teflon) ทนความร้อน ทนกรด ทนด่างได้ดี สามารถ autoclave ได้

1. น้ำที่ใช้ในห้องปฏิบัติการหรือ reagent grade water แบ่งได้เป็น 3 ชนิด ได้แก่

5.1 Type I เป็นน้ำที่มีความบริสุทธิ์สูง ผ่านขบวนการหลายขั้นตอนได้แก่ การกรอง การกลั่น การกำจัดอิออน (deionization) การกรองผ่าน activated carbon และ membrane filter นิยมใช้ในงานที่ ต้องการความถูกต้อง ความแม่นยำสูง เช่น การเตรียม calibrator หรือ reference material การวิเคราะห์ปริมาณ trace element, การตรวจ electrolyte, การตรวจ enzyme assay

5.2 Type II ใช้ในการทดสอบทางห้องปฏิบัติการทั่วไป

5.3 Type III ใช้ในการเตรียมน้ำกลั่น Type I, Type II และงานที่ไม่ต้องการความถูกต้องมากนัก หรืองาน qualitative analysis เช่น การเตรียม cleaning solution, การเตรียมสีย้อม, การตรวจทาง urinalysis

เกณฑ์ในการประเมินคุณภาพน้ำ (NCCLS criteria) ดังแสดงในตาราง

Type I Type II Type III

pH NA NA 5.0-8.0

Resistivity (MW/cm) 10 2 0.1

Silicate (mg/L) 0.05 0.1 1.0

Bacteria (cfu/mL) 10 10³ NA

Organic material Carbon filtered NA NA

Particulate matte Membrane filtered NA NA

NA= Not applicable

6. Automatic pipette มี 2 ชนิดคือ positive displacement pipette และ negative displacement pipette

Positive displacement Negative displacement

-มีส่วนของ teflon ที่สัมผัสกับของเหลวโดยตรง -ไม่มีส่วนใดๆ ของ pipette สัมผัสกับของเหลว

-ใช้ capillary เพียงอันเดียว ไม่ต้องใช้ pipet tip -ต้องใช้ pipet tip

-Precision ดีกว่า -Precision น้อยกว่าเนื่องจากต้องเปลี่ยน pipet tip

-เหมาะสำหรับการดูดสารละลายที่ระเหยง่าย -ไม่เหมาะสำหรับดูดสารละลายที่ระเหยง่าย

การทดสอบ accuracy และ precision ของ automatic pipette ทำได้โดย

- ชั่งน้ำหนักของน้ำโดยใช้ analytical balance ทำซ้ำๆอย่างน้อย 10 ครั้ง คำนวณหาปริมาตรจากสูตร V = M/D คำนวณหาค่า mean, SD, %CV , % error โดยค่า %CV , % error ต้องอยู่ในเกณฑ์ที่กำหนด

- เจือจางสารละลายที่มีสีจากนั้นนำไปวัดค่าการดูดกลืนแสง ทำ reference dilution โดยอาศัย volumetric pipette และ volumetric flask คำนวณหาปริมาตร คำนวณหาค่า mean, SD, %CV , % error โดยค่า %CV , % error ต้องอยู่ในเกณฑ์ที่กำหนด

1. Basic unit และ derived unit ที่สำคัญในระบบ SI

Quantity Basic unit

Basic unit Length meter

Mass kilogram

Time second

Temperature Kelvin

Amount of mass mol

Derived unit Area m²

Volume m³

Substance concentration mol/m³ (mol/L )

Pressure Pascal (Pa)

1. SI Prefix ที่สำคัญ

Prefix Factor Symbol

Giga 10⁹ G

Mega 10⁶ M

Kilo 10³ k

Deci 10^-1 d

Centi 10^-2 c

Milli 10^-3 m

Micro 10^-6 m

Nano 10^-9 n

Pico 10^-12 p

1. Basic calculation:

9.1 เปลี่ยนหน่วย

1. 100 mL = ……. mL

= 0.1 mL

1. 0.9 mg = …… mg

mg =

3. 90 mg/dL glucose เปลี่ยนเป็นหน่วย mmol/L มีค่าเท่าใด (MW = 180)

mmol/L =

= 5

9.2 Concentration

% w/v ( g/100 mL solution)

% w/w (g/100 g solution)

% v/v (mL/100 mL solution)

1. ต้องการเตรียม 0.85 % NaCl ปริมาตร 250 mL จะต้องชั่ง NaCl เท่าใด

= 2.125 g

2. ต้องการเตรียม NaOH 500 g ความเข้มข้น 10 % w/w ต้องชั่ง NaOH กี่กรัม

= 100 g

ดังนั้นต้องชั่ง NaOH มา 100 g แล้วเติมน้ำหนัก 500-100 = 400 g

3. ต้องการเตรียม 20 % v/v ethanol ปริมาตร 200 mLจะต้องใช้ปริมาตรเท่าใด

= 40 mL

ต้องใช้ absolute ethanol ปริมาตร 40 mL ผสมกับน้ำกลั่น 200-40 = 160 mL

Molarity (mol solute /L solution)

Normality (Equivalent solute/L solution, N = Ma เมื่อ a คือ valence)

1. ต้องการเตรียม 0.15 M ปริมาตร 500 mL ต้องชั่ง NaCl มาเท่าใด (MW = 58.5)

= 4.3875 g

หรือ mol NaCl = 0.15 x500/1000 = 0.075

g NaCl = 0.075 x 58.5 = 4.3875

2. ต้องการเตรียม 0.5 N ปริมาตร 250 mL จะต้องใช้ conc H₂SO₄ปริมาตรเท่าใด (กำหนด

%assay = 98, specific gravity = 1.84, MW = 98)

% assay = 98, specific gravity = 1.84 หมายความว่า 1 mL หนัก 1.84 กรัมและ 98%ของสารละลายเป็น H₂SO₄

Þใน conc H₂SO₄ 1 mL มี H₂SO₄หนัก = g

ใน conc H₂SO₄ 1000 mL มี H₂SO₄หนัก =

mol

หรือคำนวณหา molarity จากสูตร

= = 18.4

จากสูตร N = Ma

N = 18.4 x2 = 36.8

จากสูตร C₁V₁ = C₂V₂

36.8 x V₁ = 0.5 x 250

V₁ = 2.72

นั่นคือ ต้องใช้ conc H₂SO₄ ปริมาตร 2.72 mL เจือจางด้วยน้ำกลั่นให้มีปริมาตร 250 mL

3. สารละลายประกอบด้วย Ba(OH)₂ 4.5 g ในสารละลายปริมาตร 400 mL จงคำนวณหา normality

= 0.054

จากสูตร N = Ma

N = 0.054 x2 = 0.108

Water of Hydration

สารเคมีบางชนิดอยู่ในรูป hydrate form ในการเตรียมสารจะต้องคำนึงถึงโมเลกุลของน้ำที่รวมอยู่กับสารเคมีนั้นๆ

1. ต้องการเตรียม 1.0 M CaCl₂ ปริมาตร 500 mL จะต้องชั่ง CaCl₂.2H₂O กี่กรัม (MW CaCl₂= 111, MW CaCl₂.2H₂O = 146)

g CaCl₂ = 0.5 x 111 = 55.5

111 g CaCl₂ = 55.5 g CaCl₂

146 g CaCl₂.2H₂O X g CaCl₂.2H₂O

X = 73

ต้องชั่ง CaCl₂.2H₂O 73 กรัม ละลายน้ำแล้วปรับปริมาตรเป็น 500 mL

9.3 Dilution

1. ในการวิเคราะห์หนึ่งใช้ serum ปริมาตร 0.1 mL, reagent ปริมาตร5 mL, DW ปริมาตร4.9 mL อยากทราบว่า dilution ของ serum ใน final solution เป็นเท่าใด

Dilution = ปริมาตรของ serum/ ปริมาตรสุดท้ายของ solution

= 0.1/(0.1+5 +4.9)

= 1:100 (1/100)

1. 5 N HCl ถูกเจือจาง 1:4 จากนั้น solution ถูกเจือจางต่ออีก 4:15 อยากทราบ final concentration ของ HCl

Final conc. = 5 x 1/4 x 4/15 =0.33 N

1. ในการตรวจวัด creatinine ใน urine ทำการเจือจาง urine 1:20 จากนั้นนำไปทำปฏิกิริยากับ

reagent และวัด absorbance ของ unknown (Au) ได้ = 0.5 วัด absorbance ของ standard ได้เท่ากับ 0.25 จงหาความเข้มข้นของ creatinine ใน urine กำหนด conc. ของ standard =5 mg/dL

Cu = Au x Cs/As x dilution factor

ในที่นี้ urine ถูกเจือจาง 1:20 (หรือ dilution =1:20) ดังนั้น dilution factor ที่ต้องนำมาคูณ คือ 20

Cu = 0.5 x 5/0.25 x 20 mg/dL = 200 mg/dL

ในกรณีที่ต้องการหาความเข้มข้นใน 24 h urine ต้องนำปริมาตรทั้งหมดมาคำนวณด้วย

หากปริมาตร urine = 2000 mL/24 h

ความเข้มข้น = (200 mg/100 mL) x (2000 mL/24 h) = 4000 mg/24 h = 4 g/24 h

1. สารเคมีที่ใช้ในห้องปฏิบัติการโดยทั่วไปเป็นชนิด reagent grade ซึ่งเป็นสารเคมีที่มีความบริสุทธิ์ตามมาตรฐานของ American Chemical Society

สารเคมีที่มีความบริสุทธิ์สูง หรือ ultra-pure reagent ใช้ในงานเฉพาะที่ต้องการความบริสุทธิ์สูงเช่น spectrograde สำหรับงานวิเคราะห์ทาง spectrophotometry, HPLC grade สำหรับงานวิเคราะห์ด้วย HPLC

1. Reference material หมายถึงสารที่ทราบคุณสมบัติทางเคมีหรือฟิสิกส์ที่แน่นอน ใช้สำหรับการ calibration, ประเมินความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์และใช้กำหนดความเข้มข้นของสารอื่น แบ่งเป็น
   1. Primary reference material เป็นสารเคมีที่มีความบริสุทธิ์สูง มีความคงตัว ไม่ดูดความชื้น ใช้ในการเตรียมสารละลายที่มีความเข้มข้นที่แน่นอน
   2. Secondary reference material หมายถึงสารที่มีการกำหนดค่าโดยเทียบกับ primary reference material
   3. Certified reference material (CRM) หมายถึง สารที่ทราบปริมาณหรือความเข้มข้นที่แน่นอน มีเอกสารรับรองจากหน่วยงาน เช่นในกรณีของ National Institute of Standards and Technology (NIST) ได้ผลิต CRM โดยใช้ชื่อว่า Standard Reference Material (SRM)
2. การป้องกัน Biological hazard ห้องปฏิบัติการจะต้องมี universal precaution หรือข้อปฏิบัติทั่วไปเพื่อป้องกันการติดเชื้อ โดยถือว่าเลือดหรือของเหลวจากร่างกายมนุษย์มี infectious agent เช่น Hepatitis, HIVและ blood-born pathogen อื่น (ควรทราบ universal precaution, เครื่องหมาย Biohazard)

13. การเก็บ specimen

Plasma glucose NaF or iodoacetate plasma

(recommended),Heparinized plasma, EDTA

plasma, Serum

Electrolytes Serum, Heparinized plasma (Li- heparin)

ไม่ใช้ EDTA, Oxalate, Citrate, NaF

Enzymes Serum, Heparinized plasma

*EDTA, Oxalate, Citrate ยับยั้ง ALP, Amylase

*EDTA, Citrate, NaF ยับยั้ง CK

*Oxalate ยับยั้ง LD

Blood gas Heparinized whole blood

Hb A₁ EDTA, Citrate, or NaF whole blood

Fructosamine Serum

Lipids EDTA plasma, Heparinized plasma, Serum

(งดอาหารอย่างน้อย 12 ชม.)

หมายเหตุ: ammonium heparin ทำให้การตรวจ BUN โดย urease method ได้ค่าสูง

NaF plasma ทำให้การตรวจ BUN โดย urease method ได้ค่าต่ำ

- การรัดแขนผู้ป่วยนานเกินไปทำให้ protein และสารที่จับกับโปรตีนมีค่าสูงขึ้น เช่น total protein, albumin, total calcium, enzymes, lipids, iron

- ภาวะ hemolysis ทำให้การทดสอบต่อไปนี้มีค่าสูงกว่าความเป็นจริง: potassium, ACP, LDH, AST, ALT, Iron, Magnesium, Phosphate

- NaF ยับยั้งเอนไซม์ Enolase ซึ่งเป็นเอนไซม์ในขบวนการ glycolysis ทำให้ลดการสลายglucose

iodoacetate ยับยั้งเอนไซม์ Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

- วิธีการเก็บ 24 h urine:ให้ผู้ป่วยปัสสาวะทิ้งไปก่อน เริ่มจับเวลาและให้ผู้ป่วยเก็บปัสสาวะทุกครั้งในภาชนะที่กำหนด จนครบ 24 h ให้ผู้ป่วยเก็บครั้งสุดท้าย อาจมีการใช้ preservative หรือเก็บปัสสาวะไว้ในตู้เย็นตลอดเวลา

14. Spectrophotometry

ส่วนประกอบที่สำคัญ

Lamp Monochromator Cuvette Detector Meter/Read out

Lamp: ที่นิยมใช้คือ Tungsten lamp (ให้แสง VIS เท่านั้น), Tungsten halogen หรือTungsten halide (ให้แสง UV-VIS)

Monochromator: ทำหน้าที่แยกแสงให้เป็นแสงสีเดียว (monochromatic light) ได้แก่

interference filter, prism, grating

Cuvette: ถ้าใช้ glass cuvette จะวัดได้เฉพาะ VIS สำหรับ quartz และ plastic ใช้ได้ทั้ง UV-

VIS

Detector: นิยมใช้ photomultiplier tube เครื่องอัตโนมัติรุ่นใหม่ๆบางเครื่องใช้ photodiode

array ซึ่งสามารถวัดได้หลายๆความยาวคลื่นในคราวเดียวกัน

Beer’s Law: A = abc

หรือ A = ebc เมื่อ e = molar absorptivity, c = conc. (mol/L)

ความสัมพันธ์ระหว่าง absorbance กับ transmittance: A = 2-log %T

สารที่ใช้ในการ calibrate ความยาวคลื่นของspectrophotometer ได้แก่

1. Mercury lamp, Deuterium lamp

2. Filter เช่น Didymium filter, Holmium oxide filter

3. Solutions of stable chromogen e.g. cobalt ammonium sulfate, copper sulfate, Holmium oxide

การหาความเข้มข้น

1. กรณีที่ทราบ absorptivity, c = A/eb

1. การทำ standard พร้อมกับ unknown, Cu = Au x (Cs/As) หรือ Cu = Au x Factor

เมื่อ factor = (Cs/As)

กรณีที่มีการเจือจางตัวอย่าง Cu = (Au. Cs/As) x dilution factor

Reagent blank = reagent + DW ทำเพื่อ correct สีของ reagent

Sample blank = sample + Diluent (NSS, or DW) ทำเพื่อ correct สีของ sample ในกรณีที่ sample ขุ่น มี hemolysis, หรือ มีภาวะ icterus

Bichromatic measurement: หมายถึงการวัด absorbance ที่ความยาวคลื่น 2 ความยาวคลื่นในคราวเดียวกัน ทำเพื่อ correct สีของ sample ที่อาจมีการรบกวนจากสาร interference เช่น Hb, lipid, bilirubin

Band pass หรือ Band pass width: หมายถึง ช่วงของความยาวคลื่นที่ให้ transmittance เป็นครึ่งหนึ่งของ peak transmittance มีประโยชน์คือใช้บอกถึงความบริสุทธิ์ของแสงที่ผ่านจาก monochromator

1. Nephelometry, Turbidimetry เป็นการวัดการกระจายของแสง (light scatter) เมื่อแสงจาก light source ผ่าน momochromator มากระทบโมเลกุล โดย turbidimetry จะมี detector อยู่ในแนวเดียวกับ light source ส่วน nephelometry จะมี detector เอียงทำมุมกับ light source
2. Flame-emission photometry

Flame ทำให้อะตอมของธาตุอยู่ในสภาวะ excited state ซึ่งไม่เสถียร จึงมีการเคลื่อนที่กลับ ground state พร้อมกับปล่อยพลังงานออกมาในรูป emitted light

1. Atomic absorption spectrophotometry (AAS)

Flame ทำให้อะตอมของธาตุอยู่ในสภาวะ ground state เมื่อให้แสงจาก hollow cathode lamp ส่องผ่าน flame อะตอมจะมีการดูดกลืนแสงบางส่วน แสงที่ผ่าน flame ไปกระทบ detector จะมีความเข้มลดลง แสงที่ถูกอะตอมดูดกลืนเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้น

Lamp ที่ใช้ใน AAS มีลักษณะที่สำคัญคือที่ cathode จะเคลือบด้วยโลหะที่ต้องการวิเคราะห์ เรียก lampนี้ว่า Hollow cathode lamp

1. Automated analyzer
   1. หลักการทำงานของ Automated analyzer

เครื่องดูด sample และ reagent มาผสมกันตามวิธีที่กำหนดของแต่ละเครื่อง (เช่น ใช้ stirring rod, ultrasonic energy , centrifugal force หรือ การเขย่า) จากนั้น incubate ใน dry bath หรือ water bath เพื่อให้เกิดปฏิกิริยาแล้วติดตามปฏิกิริยาที่โดย photometer, reflectance photometer, fluorometer, fluorescence polarization fluorometer, หรือ luminometer

2. Discrete analyzer หมายถึงเครื่องที่มีการเกิดปฏิกิริยาระหว่าง sample กับ reagent แยกกันในแต่ละ sample โดยทั่วไปการเกิดปฏิกิริยาเกิดขึ้นใน cuvette

1. การกำหนดปริมาตรของ Automated analyzer ทำได้โดยใช้ positive displacement pipette
2. Random access analyzer หมายถึง เครื่องที่สามารถเลือกทดสอบบางรายการจากที่มีอยู่ และเลือกตรวจวัดตัวอย่างใดได้โดยไม่ต้องเรียงตางลำดับ
3. Quality Assurance

%CV = (SD x 100)/mean

Within- run precision (= Optimal condition variance, OCV): ทำได้โดยวิเคราะห์ control ชนิดเดียวกัน จำนวนอย่างน้อย 20 aliquots ในรอบเดียวกัน แล้วนำมาคำนวณ mean ,SD, %CV

Day-to-day precision (= Routine condition variance, RCV): ทำได้โดยวิเคราะห์ control ชนิดเดียวกัน วันละ 1 aliquot จำนวนอย่างน้อย 20 วันแล้วนำมาคำนวณ mean , SD, %CV

การประเมิน precision ตามเกณฑ์ของ CLIA’88 S_obs < S_A

4 x S_obs < E_A

. Shewhart chart (Levey-Jennings Chart) ใช้ในการประเมิน precision และ long term accuracy

การเตรียม:

1. วิเคราะห์ control material วันละ 1 ครั้งอย่างน้อย 20 วัน
2. คำนวณ mean, SD หากมีข้อมูลที่เกิน mean ± 3SD ให้ตัดค่านั้นออกแล้วคำนวณ mean, SD ใหม่
3. สร้าง chart โดยแกน x เป็น เวลา(วัน) หรือ run number แกน y เป็นความเข้มข้น
4. ลากเส้น mean, mean ± 1SD, mean ± 2SD(Warning line), mean ± 3SD
5. ในวันต่อๆไป วิเคราะห์ control material แล้ว plot ลงบน chart และแปลผล
6. ผลการวิเคราะห์ 95 % ควรจะมีค่าในช่วง mean ± 2SD หรือการวิเคราะห์ 20 ครั้งต้องมี 19 ครั้งอยู่ในช่วง mean ± 2SD
7. มีการกระจายของข้อมูลอยู่ทั้ง 2 ด้านของ mean
8. ไม่มีผลที่เพิ่มหรือลดลงติดต่อกันมากกว่า 5 ครั้ง
9. ไม่มีค่าที่อยู่นอก mean ± 2SD ติดกัน 2 ครั้ง

การแปลผล

5. ไม่มีค่าใดอยู่นอก mean ± 3SD

Shift หมายถึง การที่ผลการวิเคราะห์ที่มีการเพิ่มขึ้นหรือลดลงอย่างรวดเร็วและคงอยู่ใน ระดับนั้น หรือมีการเปลี่ยนแปลงค่า mean โดยมีสาเหตุจากการเปลี่ยนแปลงวิธีวิเคราะห์ใหม่, เปลี่ยน reagent หรือ standard ใหม่, มีความผิดปกติของเครื่องมือในทันที

กรณีที่เตรียม standard ที่มีความเข้มข้นน้อยกว่าความเป็นจริง จะทำให้เกิด upward shift ( เนื่องจาก Cu = Au x (Cs/As) เมื่อ As น้อยกว่าความเป็นจริง ดังนั้นความเข้มข้นที่คำนวณจึงสูงกว่าความเป็นจริง

Trend หมายถึง การที่ผลการวิเคราะห์ที่มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นหรือลดลงติดต่อกัน โดยมีสาเหตุจาก reagent เสื่อม, standard เสื่อมหรือมีการระเหยของน้ำ, หรือเครื่องมือเสื่อมคุณภาพ

Westgard Multirule Chart

1-2S Control 1 ค่ามีค่าเกิน mean + 2SD หรือ mean –2SD (Warning rule)

1-3S Control 1 ค่ามีค่าเกิน mean + 3SD หรือ mean –3SD (Random error)

R-4S Control 2 ระดับในรอบเดียวกันมีค่าต่างกันเกิน 4SD (Random error)

2-2S Control 2 ค่าติดกันมีค่าเกิน mean + 2SD หรือ mean –2SD

หรือ control 2 ระดับในรอบเดียวกันมีค่าเกิน mean + 2SD หรือ mean –2SD

4-1S Control 4 ค่าติดกันมีค่าเกิน mean + SD หรือ mean –SD

หรือ control 2 ระดับแต่ละระดับมีค่าเกิน mean + SD หรือ mean –SD

10-x Control 10 ค่าติดกันอยู่ด้านใดด้านหนึ่งของค่า mean

หรือ control 2 ระดับแต่ละระดับมีค่า 5 ค่าติดกันอยู่ด้านใดด้านหนึ่งของค่า mean 2-2S, 4-1S, 10-x แสดงถึง Systematic error

วิธีการประเมิน accuracy ทำได้โดย

1. วิเคราะห์ reference material แล้วเปรียบเทียบค่าที่ได้กับ target values ของ reference material
2. เปรียบเทียบกับ definitive method หรือ reference method โดยการวิเคราะห์ตัวอย่างเดียวกันทั้ง test method และ reference method (หรือ definitive method) คำนวณหา regression equation (y = a + bx) จากนั้นคำนวณหา bias (= ½y - x½ หรือ ½a + bx_c - x_c½ ) ค่าที่ได้ต้องไม่เกิน allowable bias จึงจะถือว่า test method มี accuracy เช่นเดียวกับ reference method (หรือ definitive method)
3. หา % recovery โดยเติม standard ลงในตัวอย่างแล้วนำไปตรวจวัดหาความเข้มข้นของสารที่ต้องการวิเคราะห์ (= test ) ขณะเดียวกันเติมน้ำกลั่นปริมาตรเท่ากับ standard ลงในตัวอย่างอีกหลอดหนึ่ง นำไปตรวจวัดความเข้มข้น (= baseline)

ความเข้มข้นของ standard ที่ตรวจวัดได้ = test – baseline

ความเข้มข้นของ standard ที่เติม = Conc. standard x mL standard

mL standard + mL sample

% Recovery = ความเข้มข้นของ standard ที่ตรวจวัดได้ x 100

ความเข้มข้นของ standard ที่เติม

1. Serum protein ที่สำคัญได้แก่

Albumin: มีปริมาณมากที่สุด รักษา osmotic pressure/ขนส่งสารชนิดต่างๆ

Ceruloplasmin ขนส่ง copper

a₁-antitrypsin Protease inhibitor, ค่าสูงในภาวะ inflammation (เป็น acute phase

reactant), cirrhosis, hepatocellular carcinoma

a₁- fetoprotein ค่าสูงขึ้นใน hepatocellular carcinoma

Haptoglobin ขนส่ง free hemoglobin ใน plasma ค่าต่ำลงในภาวะintravascular

hemolysis

Hemopexin ขนส่ง heme ใน plasma

Transferrin ขนส่ง iron

Transthyretin (Prealbumin) ขนส่ง thyroid hormone, retinol

Total protein สูงขึ้นใน multiple myeloma (albumin ลดต่ำลง)

Albumin ต่ำลงใน malnutrition, malabsorption, chronic liver disease, GI loss, renal disease

- การหา total protein นิยมใช้วิธี Biuret method ซึ่งมีหลักการคือ Cu²⁺ ทำปฏิกิริยากับ peptide bond ได้ complex ที่มีสี

- วิธีการหา total protein ที่เป็น reference method คือ Kjeldahl method

- การทำ serum protein electrophoresis ที่ pH 8.2 จะพบ protein ที่เคลื่อนที่ไปที่ anode ได้ไกลที่สุดคือ albumin

21. Enzyme

- Zero order kinetic:ความเร็วของปฏิกิริยาไม่ขึ้นกับปริมาณ substrate ทุกๆโมเลกุลของเอนไซม์จับอยู่กับ substrate ในรูป ES complex ใน reaction mixture ประกอบด้วย substrate ปริมาณมากเกินพอ (excess) ปริมาณเอนไซม์คงที่

ในการตรวจวัด enzyme activity ปฏิกิริยาเป็นแบบ zero order kinetics (substrate มีปริมาณมากเกินพอ rate ของปฏิกิริยาขึ้นกับ enzyme เท่านั้น

Enzyme ที่สำคัญ

AST มีมากในหัวใจ กล้ามเนื้อ ตับ มีค่าสูงขึ้นใน AMI, Myositis, Liver disease (e.g.,

hepatitis, cirrhosis), Pulmonary infarction, Acute pancreatitis

ALT มีมากในตับ ไต หัวใจ กล้ามเนื้อ

ALT สูงขึ้นใน hepatitis, cirrhosis, carcinoma of liver

ใน alcoholic hepatitis จะพบว่า AST > ALT

CK พบมากในกล้ามเนื้อ หัวใจ สมอง

CK-1 (BB) เคลื่อนที่ไปได้ไกลที่สุดในการทำ electrophosis

CK-2 (MB) พบมากในกล้ามเนื้อหัวใจ

CK-3 (MM) พบมากในกล้ามเนื้อ เป็น CK ที่พบมากที่สุดใน serum

LD ค่าสูงใน AMI, Hepatitis, shock, anoxia

LD-1, LD-2 สูงขึ้นใน AMI

LD-4, LD-5 สูงขึ้นใน liver disease

ALP พบมากใน bone, liver, kidney, intestine, placenta

ค่าสูงขึ้นใน post hepatic jaundice, bone tumor

GGT ค่าสูงขึ้นใน post hepatic jaundice

Amylase, Lipase ค่าสูงใน pancreatitis

ACP ค่าสูงใน prostatic carcinoma

Cholinesterase ค่าต่ำลงในคนที่ได้รับ organophosphate, liver disease, ได้รับยาบางชนิดเช่น oral contraceptive

22. Lipids and Lipoproteins

Lipoprotein	Sources	Functions
Chylomicrons	ลำไส้	ขนส่ง exogenous lipid จากลำไส้ไปตับและเนื้อเยื่อ
VLDL	ตับ	ขนส่ง endogenous lipid จากตับไปเนื้อเยื่อ
LDL	VLDL catabolism	ขนส่ง endogenous lipid ไปยังเนื้อเยื่อ
HDL	ตับ ลำไส้	ขนส่ง cholesterol จากเนื้อเยื่อสู่ตับ (reverse cholesterol transport)

Chylomicrons: มีไขมันส่วนใหญ่เป็น Triglyceride, apo ที่สำคัญคือ apo B-48

VLDL: มีไขมันส่วนใหญ่เป็น Triglyceride, apo ที่สำคัญคือ apo B-100

LDL: มีไขมันส่วนใหญ่เป็น Cholesterol ค่าสูงแสดงถึงความเสี่ยงต่อ coronary heart disease

HDL: มีไขมันส่วนใหญ่เป็น Cholesterol, apo เป็นชนิด apo A, ค่าสูงแสดงถึงความเสี่ยงต่อ coronary heart disease น้อย

Friedewald formula:

LDL-C = TC – HDL-C – TG/5

- การที่ postprandial serum มีลักษณะขุ่นเนื่องจากมี chylomicrons สูง

- กรณีที่มีการสลายไขมันมากๆ จะมีการสร้าง ketone bodies ซึ่งได้แก่ acetoacetic acid, b-hydroxy butyric acid, acetone

- การทำ lipoprotein electrophoresis จะแยกชนิดของ lipoprotein บน cellulose acetate ได้เป็นดังนี้ chylomicron, b-lipoprotein (LDL), pre b -lipoprotein(VLDL), a-lipoprotein (HDL)

23. Liver function test

Pre-hepatic jaundice: AST, ALT, LD, Total bilirubin, Unconjugated bilirubin สูง

Hepatic jaundice: AST, ALT, ALP, Total bilirubin (unconjugated & conjugated)

Urine bilirubin, urine urobilinogen สูง

Post hepatic jaundice: ALP, GGT, AST, ALT, Total bilirubin (conjugated bilirubin)

- ภาวะที่พบ total bilirubin สูงและ bilirubin ส่วนใหญ่เป็น unconjugated bilirubin ได้แก่ hemolytic anemia, ineffective erythropoiesis, Gilbert syndrome, physiologic jaundice, Crigler-Najjar syndrome

- ภาวะที่พบ total bilirubin สูงและ bilirubin ส่วนใหญ่เป็น conjugated bilirubin ได้แก่ hepatitis, gallstone, cholangitis, cholangiocarcinoma, metastatic tumor, tumor of head of pancreas, Rotor’s syndrome, Dubin-Johnson syndrome

- Bilirubin เกิดจากการที่ heme จากเม็ดเลือดแดงและ heme-proteins ถูกเปลี่ยนเป็น biliverdin จากนั้น biliverdin ถูกเปลี่ยนเป็น bilirubin และถูกขนส่งไปที่ตับ

- Bilirubin ถูก conjugate กับ glucuronic acid ได้ bilirubin monglucuronide และbilirubin diglucuronide โดยเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับขบวนการ conjugation คือ UDP-glucuronyl transferase

- Metabolite ที่เกิดจากการที่ bacteria ในลำไส้ย่อยสลาย bilirubin คือ urobilinogens

- Bilirubin ที่พบใน serum มีหลายรูปดังนี้

1. Unconjugated bilirubin (a -bilirubin)
2. Bilirubin monoglucuronide (b-bilirubin)
3. Bilirubin diglucuronide (g-bilirubin)
4. d-bilirubin

Bilirubin ที่พบใน serum ส่วนใหญ่เป็น unconjugated bilirubin

1. Thyroid function tests

Hypothyroidism T_4, Free T₄ ต่ำ, TSH สูง

Hyperthyroidism T₄, Free T₄ สูง, TSH ต่ำ

Increased TBG T₄ สูง, Free T₄ ปกติ

Thyroid hormone ที่มีปริมาณมากที่สุดใน plasma คือ T₄

25. Hormones

Hormones ชนิด Sources หน้าที่

Estrogens Steroid Ovaries Female sex characteristics

Testosterone Steroid Testes Male sex characteristics

Progesterone Steroid Corpus luteum เตรียมผนังมดลูกสำหรับการฝังตัว

ของตัวอ่อน

Cortisol Steroid Adrenal cortex CHO & lipid metabolism, anti-

insulin effect

Aldosterone Steroid Adrenal cortex กระตุ้นการดูดกลับ Na⁺ และการ

ขับ K⁺

Epinephrine, Amino acid- Adrenal medulla กระตุ้น glycogenolysis, เพิ่ม heart

Norepinephrine derivative rate & BP

T₃, T₄ Amino acid- Thyroids ควบคุม metabolism, เพิ่ม blood

Derivative glucose

GH Protein Ant.Pituitary กระตุ้นการเจริญเติบโต

LH Protein Ant.Pituitary กระตุ้น corpus luteum ให้สร้าง

progesterone

กระตุ้นการสร้าง androgen ใน

ผู้ชาย

FSH Protein Ant.Pituitary กระตุ้น ovaries ให้สร้าง follicle

กระตุ้นการสร้าง sperm

TSH Protein Ant.Pituitary กระตุ้นการสร้าง thyroid hormone

ACTH Protein Ant.Pituitary กระตุ้นการสร้าง adrenocortical

hormone

Prolactin Protein Ant.Pituitary กระตุ้นการสร้างน้ำนม

ADH Protein Post.Pituitary กระตุ้นการดูดกลับน้ำ

PTH Protein Parathyroid ควบคุมระดับ Ca ²⁺, PO₄ ^3-

Insulin Protein Pancreas ลดระดับน้ำตาลในเลือด

Glucagon Protein Pancreas เพิ่มระดับน้ำตาลในเลือด

1. Non-protein nitrogenous compound

- ร่างกายขับถ่าย nitrogen ในรูป urea, creatine, creatinine, uric acid, ammonia

- สาร Non-protein nitrogenous compound ที่มีปริมาณมากที่สุดใน serumคือ urea

- การประเมิน glomerular filtration rate (GFR) ที่นิยมคือ creatinine clearance test เนื่องจาก creatinine เป็นสารภายในร่างกาย(endogenous compound) และวิธีการตรวจวัดง่าย อย่างไรก็ตามค่าที่ได้ไม่ดีเท่ากับ inulin clearance test

- BUN: Creatinine ratio ปกติมีค่าเท่ากับ 10-15: 1 ค่า ratio นี้สูงในภาวะ prerenal azotemia, postrenal azotemia

- Uric acid เป็น metabolite ของ Purine

- วิธีการทำ creatinine clearance

เก็บปัสสาวะ 24 ชม. ตรวจวัดระดับของ creatinine ในปัสสาวะในระหว่างที่เก็บปัสสาวะทำการเจาะเลือดเพื่อตรวจ serum creatinine

คำนวณหา creatinine clearance ดังนี้

Creatinine clearance = UV x 1.73

P A

เมื่อ U = Urine creatinine (mg/dL)

P = Plasma (Serum) creatinine (mg/dL)

V = Urine flow rate (ml/min)

A = Body surface area (m²)

1. Carbohydrate

Glycolysis การสลาย glucose ได้ pyruvate +ATP

(กรณี anaerobic condition ได้ lactate)

Glycogenesis การสร้าง glycogen จาก glucose

Glycogenolysis การสลาย glycogen ได้ glucose

Gluconeogenesis การสร้าง glucose จาก non-carbohydrate sources (lactate, glycerol )

Pentose phosphate pathway การเปลี่ยนน้ำตาล hexose เป็น ribose, การสร้าง NADPH ซึ่งจำเป็น

สำหรับการรักษาความแข็งแรงของผนังเม็ดเลือดแดง

การวินิจฉัยผู้ป่วยเบาหวาน: ระดับ fasting plasma glucose > 126 mg/dL

2 h post-prandial plasma glucose >200 mg/dL

Plasma glucose ภายหลังการได้รับน้ำตาล 2 ชั่วโมง >200 mg/dL (OGTT)

Hormone ที่ควบคุมระดับน้ำตาลในเลือด:

Insulin ลดระดับน้ำตาลในเลือด

Glucagon, Thyroxine, Catecholamine, Cortisol เพิ่มระดับน้ำตาลในเลือด

การทดสอบที่ใช้ติดตามการควบคุมระดับน้ำตาลในเลือดในระยะ 6-8 สัปดาห์ที่ผ่านมาคือ HbA1

การทดสอบที่ใช้ติดตามการควบคุมระดับน้ำตาลในเลือดในระยะ 2-3 สัปดาห์ที่ผ่านมาคือ fructosamine

Cushing’s syndrome (Cortisol สูง): ระดับน้ำตาลในเลือดสูง

Addison’s disease (Cortisol ต่ำ): ระดับน้ำตาลในเลือดต่ำ

28. Electrolyte

- Major extracellular cation คือ Na⁺

- Major intracellular cation คือ K⁺

- Anion gap คือ ผลต่างระหว่าง unmeasured anion และ unmeasured cation

คำนวณได้จากผลต่างระหว่าง measured anion และ measured cation (anion gap = [Na⁺]+[K⁺]-[Cl^-]- [HCO₃^- ] หรือ anion gap =[Na⁺-Cl^- - HCO₃^-])

ประโยชน์ – ใช้ประเมิน unmeasured anion เช่น organic acids, protein, SO₄^3-,PO₄^3- และ unmeasured cation เช่น Ca²⁺, Mg²⁺

– ประเมินผลการทดสอบทางห้องปฏิบัติการ (ประเมินว่าค่า electrolyte ถูกต้องหรือไม่)

– ประเมินภาวะ acid-base imbalance e.g. high anion gap metabolic acidosis

-การดูดกลับ Na⁺ ร่วมกับการขับ K⁺ อยู่ภายใต้การควบคุมของ Aldosterone

-Primary hyperaldosteronism จะมีระดับ Na⁺ สูงและ K⁺ ต่ำ

-ข้อแตกต่างระหว่าง direct ISE และ indirect ISE คือ

Direct ISE: ไม่ต้องมีการเจือจางตัวอย่างก่อนตรวจ ผลการตรวจไม่ถูกรบกวนจากภาวะ

Hyperlipidemia และ hyperproteinemia

Indirect ISE: ต้องมีการเจือจางตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ ผลการตรวจในรายที่มีภาวะ

hyperlipoproteinemia และ hyperproteinemia อาจไม่ถูกต้อง

-Trace element ที่เกี่ยวข้องกับการกำจัด peroxide คือ Selenium

-ระดับ trace element ใดที่ผิดปกติในผู้ป่วย Wilson’s disease คือ Copper

- Osmolality เป็นการวัดจำนวนของ dissolved particle สารที่มีบทบาทสำคัญต่อ plasma osmolality ได้แก่ Na⁺, Cl^-, glucose, urea

- การคำนวณ plasma osmolality

Plasma osmolality = 2 [Na⁺] + [glucose]/18 + [BUN]/2.8

- ระดับ plasma calcium ถูกควบคุมโดยฮอร์โมน PTH, calcitonin, vitamin D

29. Acid-base balance

- Specimen สำหรับการตรวจ blood gas คือ heparinized arterial whole blood โดยจะต้องป้องกันไม่ให้ gas เคลื่อนที่เข้า-ออกจาก specimen และจะต้องแช่ใน iced water เพื่อลด metabolism

- กรณีที่ specimen สำหรับตรวจ blood gas มีการสัมผัสกับอากาศ จะทำให้ค่าเปลี่ยนแปลงคือ PO₂ เพิ่ม

ขึ้น (เนื่องจากในอากาศมี O₂ สูงกว่าในเลือด) PCO₂ ลดลง (ในเลือดสูงกว่าในอากาศ จึงมีการแพร่ออกสู่อากาศ) pH ลดลง

- กรณีที่ specimen สำหรับตรวจ blood gas ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลานาน จะทำให้ค่าเปลี่ยนแปลงคือ PCO₂ สูงขึ้น pH ลดลง PO₂ ลดลง (เนื่องจากมี metabolism จึงมีการใช้ O₂และมีการสร้าง CO₂เพิ่มขึ้น

- Buffer ที่มีความสำคัญใน plasma คือ bicarbonate-carbonic acid buffer

- เพื่อที่จะรักษา blood pH ให้มีค่าเท่ากับ 7.4 จะต้องมีการควบคุมให้อัตราส่วนของ bicarbonate ต่อ carbonic acid เท่ากับ 20:1

- ภาวะที่มี pH ต่ำ ร่วมกับการมี dissolved CO₂ สูง คือ ภาวะ respiratory acidosis

- ภาวะที่มี bicarbonate สูง โดยที่ระดับ PCO₂ ไม่เปลี่ยนแปลง คือ ภาวะ metabolic alkalosis