หลักปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา

การปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาต้องอาศัยหลัก “ปลอดภัยไว้ก่อน (safety first)” เช่นเดียวกับการปฏิบัติงานด้านอื่นๆ แต่มีลักษณะที่แตกต่างจากงานด้านอื่นคือจะต้องเน้นเรื่องความสะอาดและ ปลอดภัยจากเชื้อจุลินทรีย์ ซึ่งอาจสรุปเป็นแนวทางปฏิบัติได้ดังนี้
1. ควรสวมเสื้อคลุมกันเปื้อน (สีขาว) ทุกครั้งเมื่อเข้าปฏิบัติการ
2. ต้องไม่นำวัสดุอุปกรณ์ที่ไม่จำเป็น เช่น กระเป๋าหนังสือ หรืออื่น ๆ มาวางไว้ในบริเวณที่จะปฏิบัติการ
3. ต้องทำความสะอาดโต๊ะปฏิบัติการ และเช็ดด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ (เอทธิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์) ทั้งก่อนและหลังปฏิบัติการ
4. ต้องล้างมือให้สะอาดด้วยสบู่ และเช็ดมือด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ ก่อนและหลังปฏิบัติการทุกครั้ง
5. ต้องฆ่าเชื้อที่เข็มเขี่ย (needle) หรือห่วงเขี่ยเชื้อ (loop) ก่อนและหลังการเขี่ยเชื้อทุกครั้ง โดยการเผาไฟบริเวณปลายอุปกรณ์ดังกล่าวให้ร้อนแดงก่อน แล้วเผาเรื่อยมาจนร้อนแดงตลอดความยาวของเส้นลวด และควรเผาให้เลยขึ้นมาถึงด้ามอีกเล็กน้อย ระวังอย่าให้มีเชื้อเหลือติดอยู่บนปลายเส้นลวดของอุปกรณ์ดังกล่าวมากเกินไป เพราะเชื้ออาจกระเด็นเปรอะเปื้อนระหว่างการเผาด้วยเปลวไฟ
6. ห้ามวางเข็มหรือห่วงเขี่ยเชื้อบนพื้นโต๊ะปฏิบัติการ ควรจัดหาภาชนะสำหรับใส่หรือวางอุปกรณ์ดังกล่าว
7. ให้ทิ้งอุปกรณ์ที่ปนเปื้อนเชื้อทุกชนิดในภาชนะที่มีน้ำยาฆ่าเชื้อ
8. ปรับระดับเปลวไฟจากตะเกียงให้พอดี อย่าให้เปลวอ่อนหรือแรงจนเกินไป กรณีที่ใช้ตะเกียงบุนเสนต้องพยายามปรับให้เปลวไฟเป็นสีน้ำเงินอย่าให้มีสี เหลือง และพยายามปรับเปลวไฟให้ต่ำที่สุดเท่าที่จะทำได้ และเมื่อเลิกใช้ตะเกียงแล้วจะต้องดับไฟทันที ถ้าใช้แก๊สจะต้องปิดวาล์วแก๊สที่ถังด้วย
9. ควรเขี่ยเชื้อในบริเวณที่ไม่มีลมพัด ถ้าลมสงบจะดีมาก
10. หมั่นทบทวนเทคนิคเบื้องต้นทางจุลชีววิทยาให้แม่นยำที่สุด เช่น เทคนิคปลอดเชื้อ (aseptic technique) เทคนิคการถ่ายเชื้อ เทคนิคการปลูกเชื้อ
11. ถ้าเชื้อหกเปรอะปื้อนบริเวณปฏิบัติการให้รีบกำจัดเชื้อโดยเทลาดด้วยน้ำยาฆ่า เชื้อ หรือเช็ดด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อให้ทั่วบริเวณด้วยความระมัดระวังและต้องแจ้งให้ อาจารย์ผู้ควบคุมทราบ
12. ถ้าเชื้อกระเด็นเข้าตา, ผิวหนัง, เศษแก้วบาด ให้แจ้งอาจารย์ที่ควบคุมทราบทันที
13. ห้ามนำเชื้อจุลินทรีย์ออกนอกห้องปฏิบัติการ ก่อนได้รับอนุญาตจากอาจารย์ผู้ควบคุมอย่างเด็ดขาด
14. ห้ามใช้ปากหรือลิ้น อม เลีย วัตถุต่างๆ เช่น ปากกา ไม้บรรทัด บุหรี่ ฯลฯ และห้ามดื่มหรือรับประทานอาหารหรือสิ่งใดๆ ในห้องปฏิบัติการโดยเด็ดขาด และหลีกเลี่ยงการกระทำใดๆ ซึ่งอาจทำให้เกิดการติดเชื้อเข้าสู่ร่างกายได้
15. หลอดอาหารหรือจานเพาะเชื้อที่ปลูกเชื้อแล้ว ก่อนนำไปบ่มจะต้องเขียนบันทึกรายละเอียดที่จำเป็น ด้วยปากกาหรือดินสอเขียนแก้วไว้บนอุปกรณ์ดังกล่าว หรืออาจเขียนไว้บนแผ่นกระดาษ แล้ววางหรือติดไว้บนอุปกรณ์ดังกล่าว ให้ชัดเจนและระวังอย่าให้หายเด็ดขาด รายละเอียดที่บันทึก เช่น รหัสเชื้อ (code number) หรือชื่อเชื้อ อาหารที่ใช้ทดสอบ อุณหภูมิที่ใช้ วันเดือนปีที่ปลูกเชื้อ วันสิ้นสุดการทดลอง ผู้ดำเนินการทดลอง เป็นต้น นอกจากนี้อาจระบุหมายเหตุที่ควรระมัดระวัง เช่น ห้ามเคลื่อนย้าย ห้ามเปลี่ยนอุณหภูมิ ห้ามเขย่า เป็นต้น
16. เช็ดและทำความสะอาดอุปกรณ์ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการอย่างสม่ำเสมอ เช่น หม้อนึ่งความดัน (autoclave) อ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ (water bath) ตู้อบความร้อน (hot air oven) ตู้บ่มเชื้อ (incubator) เครื่องนับโคโลนี (colony counter) กล้องจุลทรรศน์ เป็นต้น กรณีของกล้องจุลทรรศน์ถ้าต้องการทำความสะอาดเลนส์ ต้องเช็ดด้วยกระดาษเช็ดเลนส์เท่านั้น ห้ามใช้วัสดุอย่างอื่นเช็ดแทนโดยเด็ดขาด
17. การทิ้งเศษอาหารที่เป็นวุ้น ควรใส่ในถุงพลาสติกแล้วนำไปทิ้งในถังขยะที่จัดให้ ห้ามทิ้งเศษอาหารวุ้นลงในอ่างน้ำโดยเด็ดขาด เพราะเมื่อวุ้นแข็งตัวจะทำให้ท่อน้ำอุดตันได้
18. เครื่องแก้วที่บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อซึ่งใช้ทดสอบแล้ว ต้องนำไปรวมไว้ในตะกร้าที่จัดให้ และควรรอนำไปฆ่าเชื้อพร้อมๆ กัน เพื่อประหยัดพลังงาน
19. อุปกรณ์เครื่องแก้วที่แตกเสียหาย ควรแยกทิ้งในถังขยะที่จัดไว้ให้โดยเฉพาะ และเมื่อเกิดการเสียหายจะต้องรีบแจ้งให้เจ้าหน้าที่ประจำห้องปฏิบัติการหรือ อาจารย์ผู้ควบคุมทราบทันที เพื่อจะได้พิจารณาการชดใช้ค่าเสียหายหรือดำเนินการอย่างหนึ่งอย่างใดตามความ เหมาะสม
20. ก่อนเบิกและคืนอุปกรณ์ทุกครั้งจะต้องตรวจสภาพเครื่องมือว่าอยู่ในสภาพเรียบร้อยสมบูรณ์

คำแนะนำทั่วไปอื่นๆ ระหว่างปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา
1. ควรวางแผนล่วงหน้าว่าจำเป็นต้องใช้อุปกรณ์ชนิดใด จำนวนเท่าใด เพื่อเตรียมการจัดเบิกไว้ล่วงหน้าก่อนเวลาปฏิบัติการตามสมควร
2. จัดเก็บเครื่องมือเครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการ ให้อยู่ในสภาพเป็นระเบียบเรียบร้อยน่าดู เช่น จุกสำลีที่ใช้ควรใส่ในตะกร้าที่จัดให้ อย่าปล่อยทิ้งไว้ตามพื้นโต๊ะหรือพื้นห้อง จัดเรียงขวดสารเคมีให้เป็นระเบียบเรียบร้อย เป็นต้น
3. ปฏิบัติการทุกอย่างด้วยความระมัดระวัง อย่าประมาท เพื่อป้องกันอุบัติภัยที่อาจเกิดขึ้นระหว่างการใช้อุปกรณ์ ควรศึกษาวิธีป้องกันอุบัติภัยและการแก้ไข เพราะจะเป็นประโยชน์ต่อตนเอง และผู้อื่น เมื่อเกิดอุบัติภัยในทุกกรณีจะต้องแจ้งให้อาจารย์ผู้ควบคุมทราบในทันที เพื่อจะได้หาทางควบคุมหรือแก้ไขสถานการณ์ได้ถูกต้อง
4. ปฏิบัติงานร่วมกับผู้อื่นด้วยความเห็นอกเห็นใจ อย่าเห็นแก่ตัว ร่วมมือประสานงานด้วยความตั้งใจจริง และช่วยเหลือผู้ร่วมงานบ้างตามควรแก่กรณี
5. ควรเข้าปฏิบัติการทุกครั้ง และให้ตรงเวลา พร้อมที่จะอุทิศเวลาให้แก่การปฏิบัติงานนอกเวลาปกติได้เสมอ เมื่อว่างจากปฏิบัติการ ควรจับกลุ่มปรึกษาหารือทางวิชาการร่วมกัน อย่าใช้เวลาว่างพูดคุยในสิ่งไร้สาระ
6. ก่อนออกจากห้องปฏิบัติการ ต้องตรวจดูความเรียบร้อยทั่วไปของห้องปฏิบัติการอีกครั้งหนึ่ง เช่น อุปกรณ์ที่หลงเหลืออยู่ต้องช่วยนำส่งคืนเจ้าหน้าที่ พื้นโต๊ะหรือพื้นห้องมีน้ำเปียกต้องรีบเช็ดล้าง และเช็ดอ่างน้ำให้สะอาด ปิดแก๊ส ปิดอุปกรณ์ไฟฟ้าที่ไม่จำเป็น หรือปิดก๊อกน้ำให้เรียบร้อย ฯลฯ เมื่อพบสิ่งใดที่ไม่เรียบร้อยต้องรีบแก้ไขหรือแจ้งให้เจ้าหน้าที่ทราบ ในกรณีที่จำเป็นต้องปฏิบัติการนอกเวลาราชการจะต้องปิดประตูห้องปฏิบัติการ เพื่อป้องกันอันตรายจากผู้ร้ายหรือการโจรกรรมต่างๆ และปิดล็อกหลังจากปฏิบัติงานให้เรียบร้อยแล้วทุกครั้ง

แนะนำการใช้อุปกรณ์และเครื่องมือทางจุลชีววิทยา

ห่วงเขี่ยเชื้อและเข็มเขี่ยเชื้อ (Inoculating loop and needle)
ทั้งสองชนิดนี้เป็นเครื่องมือที่ใช้สำหรับการถ่ายเชื้อแบคทีเรียจากภาชนะ หนึ่งไปใส่ในภาชนะหนึ่ง ทำด้วยลวดที่เป็นตัวนำความร้อนที่ดี เช่น nichrome หรือ platinum มีด้ามถือที่เป็นวัสดุที่ไม่นำความร้อน ห่วงเขี่ยเชื้อมีลักษณะเป็นเส้นลวดมีปลายขดเป็นวงกลมขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง ประมาณ 4 มิลลิเมตร ส่วนเข็มเขี่ยเชื้อนั้นปลายเหยียดตรง เมื่อเวลาจะใช้เครื่องมือทั้งสองนี้จะต้องทำให้ปราศจากเชื้อโดยการเผาจน กระทั่งลวดร้อนแดงและปล่อยให้เย็นก่อนนำมาใช้

 

ภาพที่ 1 (a) เข็มเขี่ยเชื้อปลายตรง (Inoculating Needle) และ (b) ห่วงเขี่ยเชื้อ (Inoculating Loop)

ตะเกียงแอลกอฮอล์
เป็นตะเกียงแบบที่ใช้แอลกอฮอล์เป็นเชื้อเพลิงเพื่อให้ได้เปลวเพลิงเพื่อให้ ได้เปลวไฟ ใช้ประโยชน์เช่นเดียวกับตะเกียงก๊าซในกรณีที่ห้องปฏิบัติการนั้นไม่มีก๊าซ เปลวไฟจากตะเกียงแอลกอฮอล์ร้อนน้อยกว่าจากตะเกียงก๊าซมาก จึงต้องใช้เวลานานกว่าในการเผาเพื่อให้ปราศจากเชื้อ

ตะเกียงก๊าซ (Bunsen burner)
เป็นตะเกียงที่ใช้ก๊าซหุงต้มทำให้เกิดเปลวไฟสำหรับใช้เผาฆ่าเชื้อที่ติดอยู่ กับเครื่องมือบางอย่าง เช่น เข็มเขี่ยเชื้อ ปิเปต หลอดทดลอง ปากคีบ เป็นเครื่องมือที่ใช้ในกันมากในการถ่ายเชื้อ

จานเพาะเชื้อ (Petri dish)
มีลักษณะคล้ายจานทรงกระบอกแบบตื้น 2 ใบ สวมประกบกันสนิท โดยปกติทำด้วยแก้วหรือพลาสติกที่ทนความร้อน ใช้สำหรับใส่อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง (agar) ทำให้มีบริเวณเนื้อที่ผิว (surface area) กว้างเหมาะในการแยกเชื้อแบคทีเรียจากตัวอย่างส่งตรวจโดยทั่วไป

ภาพที่ 2 จานเพาะเชื้อ

หลอดเลี้ยงเชื้อ (Culture tube)
ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาจำเป็นต้องใช้หลอดทดลอง (test tube) ขนาดต่างๆ จำนวนมากเพื่อใช้ใส่อาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ หลอดทดลองที่ใช้มีทั้งแบบปิดด้วยจุกเกลียว (screw cap test tube) และแบบธรรมดาซึ่งใช้สำลีอุดเป็นจุกแล้วแต่ประเภทของอาหารที่จะใส่ในหลอดนั้น อาหารเลี้ยงเชื้อที่บรรจุในหลอดทดลองมีทั้งชนิดที่เป็นอาหารแข็งประเภทวุ้น (agar) และอาหารเหลว (broth) เมื่อบรรจุอาหารในหลอดทดลองแล้วจะต้องมีจุกปิดปากหลอดไว้เพื่อป้องกันไม่ให้ เชื้อจุลินทรีย์อื่นปนเปื้อน

หลอดดักก๊าซ (Durham tube)
เป็นหลอดทดลองขนาดเล็กประมาณ 5x50 มิลลิเมตร ใช้คว่ำลงในหลอดทดลองขนาดปกติที่บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อที่ต้องการทดสอบความ สามารถในการใช้น้ำตาลแล้วให้กรดและก๊าซ CO2 ก๊าซที่เกิดขึ้นจะลอยขึ้น จึงทำให้มีก๊าซจำนวนหนึ่งดันไล่ที่ของของเหลวแล้วถูกขังอยู่ที่ก้นหลอดดัก ก๊าซ

ภาพที่ 3 หลอดดักก๊าซ

ปิเปต (Pipette)
การถ่ายเชื้อในสภาพของเหลวหรือสารละลายจำนวนมากจากหลอดทดลอง จำเป็นต้องใช้ปิเปต ในทางจุลชีววิทยาปิเปตที่ใช้มักจะอุดปลายด้านที่สำหรับดูดไว้กรองเชื้อไม่ ให้ผ่านเข้าปาก และเพื่อป้องกันเชื้อจากปากลงสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ สำหรับนิสิตให้ใช้ลูกยางแดงในการดูดปล่อยสารละลายโดยใช้ปิเปต ห้ามใช้ปากเนื่องจากนิสิตยังไม่มีความชำนาญในการทำปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา

ชุดย้อมสี (Staining set)
โดยปกติจะประกอบด้วยขวดสีต่างๆ หลายชนิด สำหรับการย้อมสไลด์แบบ Gram’s stain, Acid fast stain หรือ Simple stain อื่นๆ โดยมากนิยมใช้ขวดสีชาเพื่อกันแสง เนื่องจากสารเคมีหลายชนิดเปลี่ยนสภาพได้ง่ายเมื่อถูกแสงสว่าง

เครื่องกรองแบคทีเรีย (Bacteriological filter)
เครื่องกรองแบคทีเรีย ซึ่งจะมีแผ่นกรองแบคทีเรีย (membrane filter) ซึ่งแผ่นกรองเหล่านี้มีรูขนาดเล็กมาก (0.22-0.45 ?m) จนกระทั่งตัวแบคทีเรียไม่สามารถผ่านได้ (แต่ไวรัสผ่านได้) ฉะนั้นสารที่ผ่านการกรองแล้วจะปราศจากแบคทีเรียและสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ที่มีขนาดใหญ่กว่ารูของกระดาษกรอง

ภาพที่ 5 ชุดกรองแบคทีเรีย

ตู้บ่มเชื้อ (Incubator)
เป็นตู้อบที่สามารถปรับอุณหภูมิได้ตามความต้องการ มีประโยชน์ในการเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย ซึ่งส่วนใหญ่เจริญได้ดีที่อุณหภูมิ 37? C วิธีใช้สะดวกเนื่องจากมีหน้าปัดสำหรับหมุนเลือกอุณหภูมิได้ตามที่ต้องการ ภายในตู้จะมีระบบปรับการไหลเวียนของอากาศทำให้อุณหภูมิสม่ำเสมอทั่วบริเวณ ต่างๆ ภายในตู้อบ

ตู้เย็น (Refrigerator)
ใช้ในการเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อที่ยังไม่ต้องการใช้ ตลอดจนสารเคมีและน้ำยาที่จำเป็นต้องเก็บรักษาในอุณหภูมิต่ำๆ เช่น ยาปฏิชีวนะ ซีรั่ม พลาสมา เลือด และอื่นๆ ในกรณีที่ต้องการเก็บแบคทีเรียไว้เป็นเวลานานๆ โดยไม่ต้องการให้แบ่งตัวเพิ่มจำนวนมากอาจเก็บไว้ในตู้เย็นได้เช่นเดียวกัน (ยกเว้นเชื้อบางชนิดที่ตายได้ง่ายที่อุณหภูมิต่ำๆ)

อ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ (Water bath)
เป็นอ่างน้ำที่ปรับอุณหภูมิได้ตามความต้องการ สามารถใช้บ่มเพาะเชื้อได้ในกรณีที่เลี้ยงเชื้อในอาหารเหลวหรือในหลอดทดลอง และใช้ในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ หรืออุ่นอาหารเลี้ยงเชื้อให้มีอุณหภูมิเหมาะสมสำหรับการทดลอง

หม้อนึ่งฆ่าเชื้อภายใต้ความดันไอน้ำ (Autoclave)
เป็นเครื่องมือที่ใช้ในการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ทุกชนิด เป็นวิธีที่นิยมใช้กันมาก ซึ่งสามารถฆ่าเชื้อได้โดยอาศัยความร้อนจากไอน้ำเดือดภายใต้ความดัน ลักษณะของเครื่องเป็นภาชนะโลหะรูปสี่เหลี่ยมหรือรูปทรงกระบอกมีฝาปิดที่แข็ง แรง ภายในมีช่องว่าง (chamber) สำหรับบรรจุสิ่งของที่ต้องการฆ่าเชื้อในลักษณะเช่นเดียวกับการนึ่ง ด้านล่างมีช่องว่างสำหรับบรรจุน้ำ ซึ่งเมื่อต้มให้เดือดจะกลายเป็นไออัดแน่นอยู่ภายใน มีอุณหภูมิสูงถึง 121?C ภายใต้ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว ตามปกติถ้าวัตถุอยู่ภายในสภาพนี้นาน 10-15 นาที จะปราศจากสิ่งมีชีวิตทุกอย่าง (sterile) เครื่องมือนี้ใช้กันมากในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ (media) และฆ่าเชื้อจากจานอาหาร, หลอดทดลอง ตลอดจนใช้ทำให้เครื่องมือเครื่องใช้ปราศจากเชื้อจุลินทรีย์

ตู้อบความร้อน (Hot air oven)
เป็นตู้อบฆ่าเชื้อโดยใช้ความร้อนแห้ง (dry heat) ที่อุณหภูมิสูงมาก เช่น อุณหภูมิ 160?C
นาน 1-2 ชั่วโมง เครื่องมือแบบนี้เหมาะสำหรับการทำลายเชื้อจากวัตถุสิ่งของที่ทนความร้อน ไม่
เสื่อมสลายเมื่อสัมผัสกับความร้อนสูงโดยตรง เช่น เครื่องแก้วต่างๆ เพื่อทำให้ปราศจากเชื้อก่อนที่
จะนำมาใช้ในการทดลองทางจุลชีววิทยา