การตรวจยืนยันผล (Confirming Test) ยาบ้าหรือยาอี

เป็นการตรวจเพื่อยืนยันว่าในตัวอย่างปัสสาวะที่ให้ผลบวกในขั้นตอนการตรวจพิสูจน์เบื้องต้นนั้น มียาบ้าหรือยาอีผสมอยู่จริงหรือไม่ โดยการตรวจปัสสาวะอีกครั้งอย่างละเอียดในห้องปฏิบัติการ
        หลักการและวิธีการ
        วิธีที่นิยม คือ โครมาโตกราฟฟี (Chromatography) ซึ่งเป็นการแยกสารผสมออกจากกัน โดยอาศัยหลักการละลายและการดูดซับที่แตกต่างกันของสาร ทำให้การเคลื่อนที่ผ่านตัวดูดซับแตกต่างกัน เป็นผลให้สามารถแยกสารผสมออกจากกันได้
        ชนิดของโครมาโตกราฟฟี

	Thin Layer Chromatography (TLC) Mobile phase เป็นของเหลว อาจเป็นสารชนิดเดียว หรือหลายชนิดผสมกันในอัตรส่วนต่างๆ กัน Stationary phase เป็น silica gel เคลือบบนแผ่นกระจกหรือแผ่น อลูมิเนียม
	Gas Liquid Chromatography (GLC, GC) Mobile phase เป็น gas เช่น Nitrogen, Helium Stationary phase เป็นแผ่นฟิล์มบางๆ ของของเหลวซึ่งเคลือบอยู่บนของแข็งที่มีขนาดเล็ก เช่น Diatomaceous Earth, PTFE resin หรือเคลือบใน column โดยตรง
	High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC Mobile phase เป็นของเหลว อาจเป็นชนิดเดียวหรือหลายชนิดผสมกัน ตามความเหมาะสม Stationary phase เป็นผงละเอียดของ Diatomaceous Earth (normal phase) หรือเป็นแผ่นฟิล์มบางๆ ของ C8, C18, CN เคลือบอยู่บนของเแข็งที่มีขนาดเล็ก เช่น Diatomaceous Earth REMEDi เป็นเครื่องมือตรวจวิเคราะห์หาชนิดของสารโดยใช้หลักการ High Performance Liquid Chromatography ชนิด multiwavelength UV detector วิเคราะห์และรายงานผลโดยโปรแกรมสำเร็จรูป ระบบการทำงานควบคุมโดยคอมพิวเตอร์
	Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GC/MS) เป็น GC ที่ต่อเข้ากับ MS หลังจากที่สารในตัวอย่างถูกแยกออกจากกันด้วย GC แล้ว จะถูกวิเคราะห์ (เอกลักษณ์และปริมาณ) โดยอาศัยคุณสมบัติของ มวล/ประจุ (Mass/Charge, m/z) ของสารนั้น วิธีตรวจยืนยันด้วย GC/MS เป็นวิธีการที่ดีที่สุด แต่สิ้นเปลืองค่าใช้จ่ายสูง ผู้ที่ทำการตรวจวิเคราะห์ต้องมีความรู้ความชำนาญเป็นอย่างดี

Thin Layer Chromatography (TLC)

                เป็นวิธีการที่สะดวก สิ้นเปลืองค่าใช้จ่ายน้อย ห้องปฏิบัติการทั่วๆ ไปสามารถทำได้
น้ำยาและวัสดุอุปกรณ์

	Plate แผ่นกระจกขนาด 20 X20 เซนติเมตร เคลือบ Silica Gel GF254 ความหนา 250 ไมครอน
	สารละลายมาตรฐาน : ละลายสารใน methanol ให้ได้ความเข้มข้นประมาณ 5 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร แอมเฟตามีน (Amphetamine) เมทแอมเฟตามีน (Methamphetamine) เอม ดี เอม เอ (MDMA) เอม ดี เอ (MDA) เอม ดี อี (MDE) อีเฟดรีน (Ephedrine) ซูโดอีเฟดรีน (Pseudoephedrine)
	สารละลายตัวอย่าง : เตรียมตัวอย่างปัสสาวะได้ 2 วิธี คือ วิธีที่ 1 ปัสสาวะ 3-5 มิลลิลิตร ปรับสภาวะความเป็นกรดด่าง (pH) ให้ได้ประมาณ 9 แล้วสกัดด้วยน้ำยาทดสอบในชุดน้ำยาตรวจหายาบ้าในปัสสาวะของกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ จำนวน 1 มิลลิลิตร แยกน้ำยาชั้นล่างที่เป็นสีม่วงใส่ใน หลอดพลาสติด ขนาด 1.5 มิลลิลิตร (ก้นหลอดรูปกรวย) ตั้งทิ้งไว้ให้แห้ง ละลาย residue ที่ได้ด้วย Methanol ประมาณ 0.5 มิลลิลิตร สำหรับทำ TLC วิธีที่ 2 ปัสสาวะ 5-10 มิลลิลิตร ใส่ในกรวยแยก เติม 1 M Sodium Hydroxide 2 มิลลิลิตร เพื่อปรับ pH ให้ได้ประมาณ 11 สกัดด้วย Dichloromethane 20 มิลลิลิตร แยกเอาชั้น Dichloromethane มาสกัดกลับด้วย 0.15 M Sulfuric acid จำนวน 2 มิลลิลิตร แยกเอาชั้นกรดนำมาปรับ pH ให้ได้ประมาณ 11 อีกครั้งหนึ่ง แล้วสกัดด้วย Dichloromethane จำนวน 5-10 มิลลิลิตร แยกเอาชั้น Dichloromethane ใส่ใน beaker ขนาดพอเหมาะและสะอาด เติม Methanolic Hydrochloric acid (Methanol : Conc. Hydrochloric acid = 9:1 โดยปริมาตร) จำนวน 2-3 หยด นำไประเหยให้แห้ง ละลาย residue ที่ได้ด้วย Methanol 100 ไมโครลิตร สำหรับทำ TLC

Developing solvents

System A	Methano                        100
	Conc. Annonia                   1.5
System B	Ethyl acetate                    85
	Methanol                         10
	Conc. Ammonia                5

Spraying reagent : Fast Black K reagent

Solution   A	1% Fast Black K salt in water
Solution   B	1 M Sodium hydroxide

วิธีทำ กำหนดตำแหน่งของสารละลายมาตรฐานแต่ละชนิดและสารละลายตัวอย่าง บนแผ่น TLC หยดสารละลายมาตรฐานลงบนแผ่น TLC ตำแหน่งละประมาณ 1 ไมโครลิตร หยดสารละลายตัวอย่างทั้งหมดทีละหยดลงบนแผ่น TLC แช่ แผ่น TLC ใน Developing solvent ที่เตรียมไว้ ให้น้ำยาเคลื่อนขึ้นไปประมาณ 10 เซนติเมตร นำแผ่น TLC ออกมาวางทิ้งให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง เพื่อไล่ Ammonia ออกให้หมด ตรวจดูตำแหน่งของสาร (Sport) บนแผ่น TLC โดย spray plate ด้วย Solution A ของ Fast Black K reagent สังเกตสีที่เกิดขึ้นแล้วจึง spray ทับด้วย Solution B สังเกตสีที่ได้ ตั้งทิ้งให้แห้ง แล้ว spray ทับด้วย Solution A อีกครั้ง

การอ่านผล

เปรียบเทียบ สี และ ค่า Rf ของตัวอย่างและสารมาตรฐานที่ปรากฏบนแผ่น TLC

Rf          =	ระยะทางจากจุดตั้งต้นถึงจุดกึ่งกลางของ spot
	ระยะทางจากจุดตั้งต้นถึงจุดที่ solvent เคลื่อนที่ไป

สีที่เกิด เมทแอมเฟตามีน อีเฟดรีน เอมดีเอมเอ (MDMA) และ เอมดีอี (MDE) จะให้สีส้ม ทันที เมื่อ spray ด้วย Solution A แอมเฟตามีน และเอมดีเอ (MDA) จะให้สีชมพู-ม่วง

ค่า Rf X 100 ของสารต่างๆ

Compound	Developing   solvents
	A	B
Amphetamine	44	66
Methamphetamine	33	63
MDA	41	62
MDMA	31	62
MDE	46	66

        ในการตรวจยืนยันผล บางาครั้งจำเป็นต้งใช้วิธีการตรวจพิสูจน์ร่วมกันหลายๆ วิธี เพื่อให้ได้ผลที่ถูกต้อง แม่นยำ เช่น การใช้ Toxi-Lab, REMEDi และ GC/MS ในการตรวจแยกยาบ้าและยาอี